番茄內(nèi)標準Apx基因探針法qPCR試劑盒實驗操作步驟

番茄內(nèi)標準Apx基因探針法qPCR試劑盒實驗操作步驟

在完成反應(yīng)體系配制后，將PCR管或96孔板短暫離心，確保液體集中于管底，避免氣泡干擾。隨后將反應(yīng)板置于qPCR儀中，按照以下程序設(shè)置擴增條件：

1. 預變性階段：95℃維持30秒，充分激活DNA聚合酶并打開模板二級結(jié)構(gòu)；

2. 循環(huán)擴增階段：95℃變性5秒，60℃退火/延伸30秒（根據(jù)引物Tm值可微調(diào)），重復40個循環(huán)；

3. 熔解曲線分析（可選）：從60℃緩慢升溫至95℃，每0.5℃采集一次熒光信號，驗證擴增特異性。

實驗過程中需注意：

- 陰性對照：設(shè)置無模板對照（NTC）以排除污染風險；

- 重復孔：每個樣本至少設(shè)3個技術(shù)重復，確保數(shù)據(jù)可靠性；

- 熒光通道選擇：若使用探針法，需匹配儀器FAM/HEX等通道，避免信號串擾。

數(shù)據(jù)分析時，采用ΔΔCt法計算目標基因相對表達量。首先用內(nèi)參基因（如Actin）Ct值校正樣本間差異，再通過實驗組與對照組的Ct差值比較獲得表達倍數(shù)變化。若熔解曲線出現(xiàn)多峰或陰性對照出現(xiàn)擴增，需排查引物二聚體或污染問題。

為提高實驗成功率，建議在正式實驗前進行預實驗優(yōu)化退火溫度及引物濃度。此外，試劑盒開封后需分裝保存，避免反復凍融影響酶活性。通過嚴謹?shù)牟僮髁鞒毯唾|(zhì)控步驟，可確保番茄Apx基因表達分析的準確性和重復性。